Jak se určují genetické predispozice pro barvy u koní aneb molekulárně-genetické testy pro chovatele a majitele koní a jejich zdravotní význam

Autoři: J. Kyselová, M. Svatoňová-Jochová, V. Czerneková, K. Ječmínková

VÚŽV, v.v.i.
Oddělení Genetiky a šlechtění
Přátelství 815
10400 Uhříněves

Barva a barevné odznaky jsou na první pohled patrnými vlastnostmi koně, které mohou nepřímo ovlivňovat také jeho odolnost a zdravotní stav. Podle genetických analýz archeologických nálezů se zdá, že původní barvou divokých koní byla uniformní hnědá, kůň byl tak ve svém prostředí nejlépe chráněn před predátory. Dnešní pestré zbarvení plemen koní ovlivňuje celá řada genů, z dosavadních studií vyplývá, že je jich známo asi 20 a jsou stále předmětem intenzivního vědeckého výzkumu. Tento krátký příspěvek do složité oblasti dědičnosti barev koňovitých neposkytuje prostor pro detailní přehled problematiky. Proto bychom rády čtenáře odkázaly na vynikající seriál ing. Pavly Chalupové, PhD., který stále vychází na EQUICHANNELu.

Jak to celé začalo

Experimentální základ pro detekci variant genů u hospodářských zvířat včetně koní a vývoj samotných genetických testů DNA byl podložen studiemi barevných mutací u myší, kde existuje asi 130 genů, které fenotyp zbarvení ovlivňují. První publikovanou „barevnou" mutací u koní byla v roce 1996 mutace v genu MC1R, kde se nachází lokus Extension - E. Lokus řídí syntézu barviva melaninu, a způsobuje přepnutí produkce eumelaninu pro černé nebo hnědé základní zbarvení na produkci phaeomelaninu typického pro ryzé zbarvení. Genetický test lokusu vychází z metodologie PCR-RFLP (polymorfismus restrikčních fragmentů DNA). při které je analyzovaný úsek DNA genu exponenciálně namnožen in vitro v PCR cykléru (PCR=polymerázová řetězová reakce) a dále enzymaticky štěpen specifickou restriktázou právě v místě analyzované mutace. Genotyp je poté stanoven elektroforézou restrikčních fragmentů DNA, které jsou rozděleny podle délky a vizualizovány UV zářením. Test je označován jako test na red faktor a využívá se hlavně u vraníků, aby se zjistilo, zda jsou nositeli recesivní alely Ee a ryzé zbarvení by se mohlo vyštěpit u jejich potomků. U ostatních zbarvení se častěji tento test kombinuje s metodicky obdobnými, jednotlivými testy pro gen ASIP (lokus Agouti - A), který zodpovídá za distribuci černého pigmentu eumelaninu po těle a vrané zbarvení srsti, a pro gen SLC45A2 neboli MATP (lokus Cream - C). Lokus Cream řídí ředění základních barev, především hnědé a ryzé na buckskin (plavák), palomino (žluťák), a nebo ještě světlejší perlino a cremello. Při testování lokusu C se provádí zkouška pro konkrétní mutaci v exonu 2 genu MATP (exon je jedna ze stavebních jednotek genu, které se překládají do výsledné bílkoviny). Jiné ředící geny a mutace, u koní fenotypově podobně vypadající jako Cream ředění, nejsou tímto testem tedy zjistitelné.

Už jde o zdraví

Z metodologie aplikačních technik PCR vychází i testování dalších dvou ředění základních barev typu Silver - Z (mutace popsána v roce 2006 v genu PMEL17) a Champagne - Ch (mutace popsána v roce 2008 v genu SLC36A1). Gen PMEL17 má, podobně jako některé další barevné lokusy, pleiotropní působení, ovlivňuje nejen ředění srsti, ale i správný vývoj oční bulvy. Přitom koně, kteří mají obě mutantní alely genu, manifestují mnohem těžší projevy očních defektů než heterozygoti s jednou mutovanou alelou. Protože gen nemá téměř žádný vliv na phaeomelanin, ředění srsti se u ryzáků neprojeví a mohou být za určitých okolností „skrytými" nositeli nevhodné alely. Důkaz, že mutace v exonu 11 genu PMEL17 je současnou příčinou vzniku zbarvení Silver a nepříznivého syndromu MCOA (Multiple Congenital Ocular Anomalies) přinesli vědci teprve nedávno.

Vzorky DNA nemocných a zdravých koní analyzovali pokročilou genomickou technologií, vysokokapacitním sekvenátorem druhé generace (NGS) americké firmy Illumina, který generuje ohromná množství sekvenačních dat. Zatímco dříve trvalo sekvenování (zjištění genetické informace obsažené v DNA) jednoho genomu roky, dnes tyto drahé technologie umožňují získat výsledky celogenomové informace jedince v řádu dní.

Hybatelem je gen KIT

Přímé genetické testy jsou už dnes také dostupné pro celou řadu z více než 20 nezávislých jednobodových mutací (označujeme je jako SNP neboli „single nucleotide polymorphisms") dosud známých v genu KIT (proto-onkogenový receptor pro tyrosin kinázu). U různých plemen a rodin koní je funkčně spojován s bílým nebo bíle skvrnitým zbarvením v široké škále fenotypů od výskytu několika bílých skvrn na tmavším podkladě až po uniformní celoplášťově bílou. Rejstřík nově detekovaných mutací v genu KIT stále roste. Zdá se, že celková plocha a snad i tvar a umístění skvrn na koňském těle jsou výsledkem výskytu různých kombinací mutací v genu KIT, společně ještě s působením dalších modifikujících genů.

Testováno může být několik různých alel White - W pro dominantní bílou a oblíbená strakatá zbarvení Sabino - SB a Tobiano - To. Přestože nebyly objeveny žádné zdravotní problémy spojené se zbarvením Sabino, chovatelé mohou využít genetický test; kvůli fenotypové rozmanitosti totiž často dochází k chybám při popisu zbarvení. Genetický test na zbarvení Tobiano je využívaný hlavně majiteli plemenných hřebců, protože dominantní sestava alel na lokusu (genotypToToToTo) vždy zajistí i od jednobarevné klisny strakaté hříbě. Pro atraktivní, nevybělující bílé zbarvení Roan - Rn nebyla příčinná mutace v genu KIT dosud identifikována, proto se provádí pouze nepřímé genetické testy. Analyzují se okolní genetické markery spojené s lokusem Roan alespoň u jednoho z rodičů a pro test jsou zapotřebí dále fotografie jedince a informace o zbarvení jeho příbuzných do 3. generace.

Značný fyziologický dopad genu KIT na metabolické systémy je jedním z důvodů, proč zrovna bílá barva je u koní spojována s vývojovým handicapem. KIT v rostoucím embryu ovlivňuje vývoj kmenových buněk krvetvorby, pohlavních žláz a růst melanoblastů, což jsou prekursory pigmentových buněk. Důsledkem mutací tohoto genu je nejen různý stupeň depigmentace kůže, ale pravděpodobně i časná embryonální mortalita popisovaná u běloušů s homozygotně dominantní sestavou alel převážně na lokusech Roan nebo White. Pro chovatele to znamená pečlivý výběr rodičovského páru na základě genetického testování, aby měli zaručen vývoj zárodku ve zdravé hříbě.

Genetické testy strakatosti odhalují dědičné vady

Jiným obvyklým vzorem strakaté bílé, hlavně v chovech plemen quarter horse, paint, pinto a minihorse, je zbarvení Overo - O. Vědci objevili příčinné mutace tohoto zbarvení v genu endothelin-B receptoru (EDNRB) již v roce 1998. Výzkum byl akcelerován snahou omezit úhyny bílých hříbat (overo lethal white syndrome, OLWS) která se rodila s přibližně 25% pravděpodobností ze spojení koní Overo a také nápadnou podobností symptomů nemocných hříbat se zákeřnou lidskou Hirschsprungovou chorobou. Výsledkem studií byl jednoduchý, přímý genetický test, který odhalí dominantní alelu OO a umožňuje vhodnou plemenitbou předejít OLWS u narozených hříbat.

Posledním z řady strakatých zbarvení je atraktivní a oblíbený Leopard komplex - LP. Toto zbarvení se často vyskytuje u koní amerického plemene appaloosa, amerických minihorsů a falabel, ale jeho nositelé jsou i asijská plemena (altajští koně, mongolský pony) a evropská plemena, např. britský strakatý pony, těžký rakouský noriker a karabaier. Příčinou jeho vzniku, který vědci objevili v roce 2013, je inzerce retrovirového elementu do genu TRPM1, která způsobuje narušení správné funkce genu. Bohužel je současně také důvodem výskytu nepříjemné dědičné vady „noční slepoty" (congenital stationary night blindness, CSNB) u homozygotních koní, tj. těch, kteří mají ve svém genotypu obě defektní alely genu TRPM1. Fenotyp zbarvení leopard komplexu může být vyjádřen od absence bílé až po extrémní výskyt symetrických bílých ploch. Exprese genu je variabilní a koně, kteří mají v genotypu identifikovánu LP alelu, nemusí nutně zbarvení leopard skutečně manifestovat. Rozsah a výskyt skvrnitosti je kromě toho kontrolován ještě minimálně jedním dalším genem, PATN1. Genetické testy byly vyvinuty pro obě příčinné mutace spojené se zbarvením leopard, jak pro gen TRPM1, tak pro vzor PATN1.

Ani bělouši to nemají snadné

Vybělující bělouši (lokus Gray - G v genu syntaxin STX17) a také strakoši Tobiano - To (zmíněný gen KIT) jsou nositelé rozsáhlých genetických přestaveb - duplikace, resp. inverze větších úseků chromozómů, proto měl vývoj metodik genetického testování těchto barev svá technická úskalí. Ani moderní genetické a genomické technologie (sekvenování na kapilární elektroforéze, vysokokapacitní genetické čipy a molekulární DNA sondy), které lze aplikovat pro testy jednoduchých mutací, zde nelze využít. Přesto existují spolehlivé komerční testy obou lokusů, založené opět na aplikacích metodologie PCR, které umožňují stanovení genotypu. Nositelé mutace v lokusu Gray trpí poměrně vysokým výskytem nezhoubného kožního melanomu. Výzkum vědců České zemědělské univerzity a Výzkumného ústavu živočišné výroby v Praze potvrdil, že melanom a vitiligo se vyvine až u 68 % starokladrubských běloušů starších 15 let. Přitom obě defektní kopie genu Gray způsobují u zvířete nejen věkem rychlejší progresi vybělování a vznik melanomu, ale např. i zhoršení fyziologického vyměšování a mají pochopitelně nepříznivý estetický dopad. Ve spojení dvou dominantních alel Silver ZZ a Gray GG působí aditivní genová interakce, která urychluje účinek vybělování tak, že jedinci s oběma těmito alelami se už rovnou rodí s bílou srstí, nebo vybělí během prvního až druhého roku života.

Testování barev ve VÚŽV v.v.i., Uhříněves

Ve Výzkumném ústavu živočišné výroby nabízíme zájemcům službu genotypování barev u koní. Nedávno jsme zde vyvinuli a patentovali ekonomicky méně náročnou a technicky jednodušší metodiku testování nositelů dominantní alely GG lokusu Gray pro progresivní vybělování během života, aplikovatelnou v chovech starokladrubského bělouše, arabských koní a plemene lipicán. Stanovujeme také základní zbarvení lokusů Extension a Aguti, ředící zbarvení Cream a strakatá zbarvení Tobiano, Sabino a Overo. Genetické analýzy DNA je možné provádět kdykoliv během života zvířete, DNA je izolována z odebraného vzorku žíní nebo krve. Genomová DNA je dlouhodobě uchována v nezměněném stavu v hlubokomrazících boxech a může být tudíž testována opakovaně. V případě komerčního testování genů zbarvení je obvyklé, že jednotlivé příčinné mutace DNA se testují zvlášť a při požadavku vícelokusového testu časová i finanční náročnost analýz narůstá. V laboratoři molekulární genetiky díky podpoře Technologické agentury ČR vyvíjíme a testujeme metodiku multiplexního analyzování několika genů barev tak, aby bylo možné získat souhrnný výsledek v jediném testu. Chtěli bychom ekonomicky optimalizovanou metodiku simultánního genetického testování barev koní nabídnout našim majitelům a chovatelům ještě v tomto roce.

Článek vznikl na základě podpory projektu TAČR Gama TG01010082

Odkazy

• Služba chovatelům nejen koní ve VÚŽV, v.v.i.
• Barevná kalkulačka
• Appaloosa projekt - vědecké poznatky pro šlechtění v praxi

Použitá literatura

• Bellone, R. R., Holl, H., Setaluri, V., Devi, S.,Maddodi, N., et al.: Evidence for a Retroviral Insertion in TRPM1 as the Cause of Congenital Stationary Night Blindness and Leopard Complex Spotting in the Horse. 2013. Plos One 8: 1932-6203
• Brooks, S. A., Lear, T. L., Adelson, D. L., Bailey, E.: A chromosome inversion near the KIT gene and the Tobiano spotting pattern in horses. 2007. Cytogenetic and Genome Research 119: 225-230
• Čížková, R.: Studium zbarvení koně metodami molekulární genetiky. 2012. bakalářská práce, ČZU Praha
• Hauswirth, R., Jude, R., Haase, B., Bellone, R. R., Archer, S., et al.: Novel variants in the KIT and PAX3 genes in horses with white-spotted coat colour phenotypes. 2013. Animal Genetics 44: 763-765
• Hofmanova, B., Vostry, L., Majzlik, I., Vostra-Vydrova, H.: Characterization of greying, melanoma, and vitiligo quantitative inheritance in Old Kladruber horses. 2015. Czech Journal of Animal Science 60: 443-451
• Mariat, D., Taourit, S., Guerin, G.: A mutation in the MATP gene causes the cream coat colour in the horse. 2003. Genetics Selection Evolution 35: 119-133
• Marklund, L., Moller, M. J., Sandberg, K., Andersson, L.: A missense mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor (MC1R) is associated with the chestnut coat color in horses. 1996. Mammalian Genome 7: 895-899
• Metallinos, D. L., Bowling, A. T., Rine, J.: A missense mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with lethal white foal syndrome: an equine version of Hirschsprung disease. 1998. Mammalian Genome 9: 426-431